Corpo centrale del complesso e principale elemento di snodo tra le varie parti, la basilica è uno degli elementi più antichi del complesso, risalente al V secolo e costruita da San Petronio, sul luogo dove un tempo vi era un tempio dedicato alla dea egizia Iside.
L’esterno dell’edificio si presenta come una ottagonale, mentre all’interno le pareti sono dodici, come si vede anche dalla sua schiacciata cupola; possenti colonne sorreggono la struttura come un anello, mentre un matroneo, corridoio sopraelevato dove le donne potevano assistere alle funzioni religiosi nell’alto medioevo, percorre l’intera struttura.
Dentro la basilica si trova il sepolcro di San Petronio, innalzato sulla base del tempio di Iside, di chi condivide sette colonne in marmo cipollino. Le spoglie del santo, ritrovate nel 1141, sono state traslate in San Petronio nel 2000.
La piccola porta protetta da una grata, rappresenta la Porta del Sepolcro, e viene aperta una settimana all’anno, alla presenza dei Cavalieri del Santo Sepolcro dopo la celebrazione della messa pasquale.
Nella basilica è presente anche una colonna in marmo nero africano, simboleggiante la colonna dove Gesù subì il martirio della flagellazione.